§ 1.6.633 - Regolamento 8 luglio 1998, n. 1459.

Regolamento (CE) n. 1459/98 della Commissione che stabilisce un metodo di riferimento per la determinazione della vanillina nel burro concentrato, nel burro o nella crema.

(G.U.C.E. 9 luglio 1998, n. L 193).

 

Art. 1.

     Il metodo di analisi specificato in allegato si applica come metodo di riferimento per la determinazione della vanillina nel burro concentrato, nel burro o nella crema ai sensi del regolamento (CE) n. 2571/97. Il burro concentrato, il burro o la crema risultano identificati ai sensi dell'articolo 6 del regolamento (CE) n. 2571/97 qualora i risultati ottenuti siano conformi alle specifiche del punto 8 dell'allegato.

 

     Art. 2.

     Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.

     Esso si applica a decorrere dal 1 settembre 1998.

 

ALLEGATO

Determinazione del contenuto in vanillina nel burro

concentrato, nel burro o nella crema, per

cromatografia in fase liquida ad alto rendimento

     1. Finalità e campo di applicazione

     Il metodo descrive un procedimento per la determinazione quantitativa del contenuto di vanillina nel burro concentrato, nel burro o nella crema. Esso si applica ai campioni ricevuti ai sensi del regolamento (CE) n. 2571/97.

 

     2. Principio

     Estrazione di una quantità nota di campione con una miscela di sopropanolo/etanolo/acetonitrile [1:1:2].

Precipitazione della maggior parte del grasso per raffreddamento fra -15 °C e -20 °C e successiva centrifugazione.

Dopo diluizione con acqua, determinazione del contenuto in vanillina per cromatografia in fase liquida ad alto rendimento (HPLC).

 

     3. Apparecchiatura

     Normale apparecchiatura di laboratorio, e in particolare:

     3.1. Congelatore, campo di temperatura da -15 °C a -20°C.

     3.2. Siringhe a perdere, della capacità di 2 ml.

     3.3. Microfiltri a membrana con pori da 0,45 ìm e resistenti a una soluzione contenente il 5% della soluzione di estrazione [4.4].

     3.4. Sistema di cromatografia in fase liquida, consistente in una pompa (della portata di 1,0 ml/min), un iniettore (iniezione da 20 ìl, automatica o manuale), un rivelatore UV (funzionante, a 306 nm, fondo scala a 0,01 AU), un registratore o integratore e un termostato a colonna funzionante a 25 °C.

     3.5. Colonna analitica [250 mm x 4,6 mm d.i.], riempita con LiChrospher RP 18 (Merck, 5 ìm) o equivalente.

     3.6. Colonna di guardia (ca. 20 mm x 3 mm d.i.), riempita a secco con Perisorb RP 18 [30-40 ìm] od equivalente.

 

     4. Reattivi

     Tutti i reattivi impiegati debbono essere di purezza analitica riconosciuta.

     4.1. Isopropanolo

     4.2. Etanolo 96% (v/v)

     4.3. Acetonitrile

     4.4. Soluzione di estrazione

Mescolare isopropanolo [4.1], etanolo [4.2] ed acetonitrile [4.3] nel rapporto 1:1:2 (V/V).

     4.5. Vanillina (4-idrossi-3-metossibenzaldeide)

     4.5.1. Soluzione di riserva di vanillina (=500 ìg/ml)

In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 50 mg circa (CM mg) di vanillina [4.5]con la precisione di 0,1 mg; aggiungere 25 ml di soluzione di estrazione [4.4] e portare a volume con acqua.

     4.5.2. Soluzione standard di vanillina (=10 ìg/ml)

Pipettare 5,00 ml di soluzione di riserva di vanillina [4.5.1] in un mastraccio tarato da 250 ml e portare a volume con acqua.

     4.6. Metanolo per HPLC

     4.7. Acido acetico glaciale

     4.8. Acqua per HPLC

     4.9. Fase mobile HPLC

     4.10. In un matraccio tarato da 1 000 ml, miscelare 300 ml di metanolo [4.6] con 500 ml circa d'acqua [4.8] e 20,0 ml di acido acetico [4.7]; portare a volume con acqua [4.8]. Filtrare per filtro da 0,45 ìm.

 

     5. Modo di operare

     5.1. Preparazione delle aliquote da analizzare

     5.1.1. Burro

Riscaldare il campione fino a fusione incipiente. Evitare il

surriscaldamento locale oltre i 40 °C. Quando il campione diventa

sufficientemente plastico, renderlo omogeneo agitando. Rimescolare il burro

per 15 secondi prima di prelevarne un'aliquota. In un matraccio tarato da

100 ml, pesare 5 g circa (Sm g) di burro, con l'approssimazione di 1 mg.

     5.1.2. Burro concentrato

Immediatamente prima di prelevare l'aliquota da analizzare, collocare il

contenitore col burro concentrato in una stufa a 40-50 °C fino a fusione

completa a rendere omogeneo il campione agitando in senso rotatorio o

rimescolando, senza eccedere in energia per evitare la formazione di bolle

d'aria. In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 4 g circa (SM g) di burro

concentrato, con l'approssimazione di 1 mg.

     5.1.3. Crema

Riscaldare il campione in bagnomaria o termostato a 35-40 °C. Distribuire

il grasso in modo omogeneo agitando in senso rotatorio e, se necessario,

rimescolando. Portare rapidamente il campione alla temperatura di 20 ± 2

°C. Il campione deve presentarsi omogeneo; in caso contrario, ripetere

l'operazione. In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 10 g (SM g) di

crema, con l'approssimazione di 1 mg.

     5.2. Preparazione della soluzione da analizzare

     Aggiungere 75 ml circa di soluzione di estrazione [4.4] all'aliquota da analizzare [5.1.1, 5.1.2 o 5.1.3], agitare o scuotere energicamente per 15 minuti circa e portare a volume con la soluzione di estrazione [4.4]. Trasferire 10 ml circa di questo estratto in una provetta fornita di tappo. Collocare la provetta nel congelatore [3.1] e lasciar riposare per 30 minuti circa. Centrifugare l'estratto freddo per 5 minuti a 2000 rpm circa e decantare immediatamente. Lasciare che la soluzione decantata raggiunga la temperatura ambiente. Pipettare 5,00 ml della soluzione decantata in un matraccio tarato da 100 ml e portare a volume con acqua. Filtrare una porzione del liquido per microfiltro a membrana [3.3]. Il filtrato è pronto per la determinazione HPLC.

     5.3. Taratura

     In un matraccio tarato da 100 ml, pipettare 5,00 ml della soluzione standard di vanillina [4.5.2]. Aggiungere 5,0 ml di soluzione di estrazione [4.4] e portare a segno con acqua. Questa soluzione contiene 0,5 ìg/ml vanillina.

     5.4. Determinazione HPLC

     Lasciar stabilizzare il sistema cromatografico per 30 minuti circa. Iniettare la soluzione standard [5.3]. Ripetere l'operazione finché la differenza di superficie o di altezza delle cuspidi fra due iniezioni successive è inferiore al 2%. Nelle condizioni descritte, il tempo di ritenzione della vanillina è di circa 9 minuti. Analizzare in doppio la soluzione standard [5.3], iniettando 20 ìl. Iniettare 20 ìl delle soluzioni [5.2]. Determinare la superficie o l'altezza della cuspide ottenuta per la vanillina. Ripetere il duplicato della soluzione standard [5.3] dopo dieci iniezioni delle soluzioni [5.2].

 

     6. Calcolo dei risultati

     Calcolare il valore medio delle superfici (o delle altezze), (AC), delle cuspidi per la vanillina associate all'iniezione in doppio effettuata per inquadrare ciascun gruppo di soluzioni (quattro superfici in totale). Calcolare il fattore di risposta (R) con la formula

R = AC/CM

dove CM rappresenta la massa della vanillina in mg [4.5.1]. Il contenuto (C) di vanillina nel campione esaminato, espresso in mg/kg, è dato dalla formula

C = AS x 20 x 0,96 / SM x R

dove

AS = area della cuspide della vanillina del campione esaminato SM = massa in g del campione esaminato [5.1.1, 5.1.2, 5.1.3]. Quando la crema viene analizzata per individuare la vanillina, la concentrazione del tracciante va espressa in mg tracciante/kg grasso di latte. A tal fine si moltiplica C per 100/f, essendo il tenore di grasso in percentuale della crema (m/m) [1];

20 = fattore che tiene conto delle diluizioni dello standard e del campione esaminato

0,96 = fattore di correzione per il contenuto in grasso nella prima diluizione del campione di prova.

Nota:

In luogo delle superfici delle cuspidi, si possono impiegare le rispettive altezze (cfr. 8.3).

 

     7. Precisione del metodo

     7.1. Ripetibilità (r)

     La differenza fra i risultati di due determinazioni eseguite nel più breve tempo possibile da un solo operatore, impiegando la stessa apparecchiatura su materiali identici, non deve superare 16 mg/kg.

     7.2. Riproducibilità (R)

     La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate da operatori in laboratori diversi, impiegando apparecchiature diverse su materiali identici, non deve superare 27 mg/kg.

 

     8. Limiti di tolleranza

     8.1. Per verificare l'omogeneità del prodotto contrassegnato, bisogna prelevare tre campioni.

     8.2. Rivelatore ottenuto partendo dalla vainiglia o dalla vanillina sintetica.

     8.2.1. La quantità di 4-idrossi-3-metossibenzaldeide da incorporare è di 250 grammi per tonnellata di burro concentrato o di burro. Quando la ricerca di traccianti riguarda la crema, il tasso di incorporazione è di 250 g/t di grasso di latte [2].

     8.2.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del tracciante: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95% (CrD95)]:

     - 221,0 mg/kg (il 95% del tasso minimo di incorporazione),

     - 159,0 mg/kg (il 70% del tasso minimo di incorporazione). La concentrazione di tracciante nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 221,0 mg/kg e 159,0 mg/kg [2].

     8.3. Rivelatore, ottenuto esclusivamente a partire da baccelli di vaniglia o loro estratti integrali.

     8.3.1. La quantità di 4-idrossi-3-metossibenzaldeide da incorporare è di 100 grammi per tonnellata di burro concentrato o di burro. Quando la ricerca di traccianti riguarda la crema, il tasso di incorporazione è di 100 g/t di grasso di latte.

     8.3.2. I risultati dell'analisi dei tre campioni del prodotto vengono utilizzati per verificare il tasso e l'omogeneità di incorporazione del tracciante: il risultato più basso ottenuto dall'analisi del prodotto viene confrontato con i seguenti limiti [si prende in considerazione la differenza critica per una probabilità del 95% (CrD95)]:

     - 79,0 mg/kg (il 95% del tasso minimo di incorporazione),

     - 54,0 mg/kg (il 70% del tasso minimo di incorporazione). La concentrazione di tracciante nel campione che dà il risultato più basso viene utilizzata per interpolazione tra 79,0 mg/kg e 54,0 mg/kg [2].

 

     9. Note

     9.1. Il valore r della ripetibilità è il valore al di sotto del quale la differenza assoluta fra i risultati di due prove singole, ottenuti applicando lo stesso metodo a materiali identici e nelle stesse condizioni (stessa apparecchiatura, stesso laboratorio e a breve distanza di tempo), può prevedibilmente rientrare in una probabilità specifica; in mancanza di altre indicazioni, la probabilità è del 95%.

     9.2. Il valore R della riproducibilità è il valore al di sotto del quale la differenza assoluta tra i risultati di due prove singole, ottenuti applicando lo stesso metodo a materiali identici ma in condizioni diverse (operatori diversi, apparecchiature differenti, laboratori differenti e/o tempi differenti), può prevedibilmente rientrare in una probabilità specifica; in mancanza di altre indicazioni, la probabilità è del 95%.

     9.3. Il recupero della vanillina aggiunta al livello di 250 mg/kg di butteroil varia da 97,0 a 103,8. Il contenuto medio ritrovato è risultato essere del 99,9% con una deviazione standard del 2,7%.

     9.4. La soluzione standard contiene il 5% di soluzione di estrazione per compensare l'allargamento della cuspide provocato dalla presenza del 5% della soluzione di estrazione nelle aliquote analizzate. Ciò consente una quantificazione attraverso l'altezza della cuspide.

     9.5. L'analisi è fondata su una curva di taratura lineare, con intercetta zero. La linearità deve essere controllata impiegando appropriate diluizioni della soluzione standard [4.5.2], la prima volta che l'analisi viene effettuata e, successivamente, a intervalli regolari, nonché dopo ogni modifica o riparazione dell'apparecchiatura HPLC.